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      實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

    2. 發布日期:2017-12-25      瀏覽次數:2230
      • 實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

        親和層析法純化的二抗

        用親和層析法純化的抗體是指,利用耦聯到瓊脂糖凝膠上的抗原將抗血清中的抗體親和層析下來。我們采用一種*的連續的洗脫過程將抗體從固態抗原上分離出來。我們提供的未標記的親和層析法純化的抗體是不含有穩定劑和防腐劑的無菌液體。耦聯標記物的抗體是凍干粉,里面含有穩定劑和防腐劑,但是過氧化物酶標記的抗體里面不含防腐劑。  

        親和層析純化抗體的選擇和定位

        *步: 選擇 Whole IgG 、 F(ab ’)2 片段,或者 Fab 片段抗體。 
        我們提供三種親和純化的二抗: Whole IgG , F(ab ’)2 片段, Fab 片段。  

        Whole IgG 抗體是從抗血清中分離出來的完整的分子。這些抗體有一個 Fc 部分和兩個與抗原結合的 Fab 部分,因此是二價的(圖 1 )。它的平均分子量約為 160KD , Whole IgG 抗體適用于多數情況,也是的。

        F(ab ’)2 片段   抗體是用胃蛋白酶消化 IgG 去除 Fc 部分,剩下兩個靠二硫鍵連接的結合抗原的 Fab 部分,依然是二價的。(圖 1 )這抗體用在特定的情況中,例如避免抗體與 Protain A  G 結合,或者與有 Fc 受體的活細胞結合。但是,如果一抗是 whole IgG ,不管二抗是哪種形式都可能出現結合 Fc 受體。這時,為了阻止抗體結合到 Fc 受體上,可以在 4 度將細胞預培養于含有疊氮鈉和二抗來源物種正常血清的緩沖液中。

        注意:當使用的是帶標記的二抗時,千萬不能用一抗來源物種的正常血清和 IgG 來封閉。如果血清中的免疫球蛋白非特異性的結合到樣品上,他們會被帶有標記的二抗識別,導致背景過高。

        牛血清白蛋白( BSA )和奶粉是zui為常用的封閉液,它們可能含有 IgG, 除了??寡?/span> IgG 外,許多二抗如抗牛,抗山羊,抗綿羊與牛 IgG 有較強的反應。因此,使用 BSA 或奶粉封閉或稀釋抗體會增加背景或降低抗體效價。推薦用來自二抗的物種的正常血清( 5% v/v )封閉。

         Fab 片段   抗體是用木瓜蛋白酶消化 IgG 后得到的。這些抗體只含有一個結合位點(圖 1 )。它們用來封閉內源性的免疫球蛋白,或者在使用相同物種來源的一抗作多標記的實驗中,用于封閉暴露的免疫球蛋白。而二價的抗體( whole IgG  F  ab’  2 片段)不能用來封閉,因為它們有二個結合位點。封閉后,一些結合位點可能為暴露出來,與一抗結合,從而導致高的背景或假陽性標記。

        第二步: 在左邊標記“ antibody description ”的攔里找到一抗的物種來源。

        抗體是根據一抗的物種來源的字母表順序排列。比如,如果一抗是小鼠來源的,就找“ anti-mouse ”。

        說明:目錄中提供了抗敘利亞倉鼠和抗亞美尼亞倉鼠的抗體。為了正確的選擇二抗,必須知道一抗是在哪種倉鼠中制備的。

        第三步: 在標有“ Host ”這一欄中選擇二抗的物種來源。

        二抗的物種來源在抗體描述的開始部分,選擇二抗的物種來源應考慮幾點: 1) 個人的取向或經驗。 二抗的質量問題與物種特異性沒有關系。2 )與蛋白A 和蛋白G 結合。兔抗體能很好地與蛋白A 和蛋白G 結合,但羊和猴抗體能更好的與蛋白G結合。 3 )經物種吸附處理的抗體可用性。某些物種來源的抗體可能不能被具有交叉反應的物種進行吸附處理。選擇經過吸附處理的物種。4 )物種兼容性。 在多標記實驗中,一些物種不能和其他物種兼容。一般地,多標記二抗必須來自同一物種。

        第四步: 在“ antibody description  下面選擇二抗的特異性。

        下面詞語的解釋將對選擇合適的抗體有所幫助。

        注意:不同來源的免疫球蛋白含有相似的結構,抗體的生成過程也相似??挂粋€物種的抗體可能與其他物種發生交叉反應, 除非特異性的經過交叉反應物種的吸附處理。在抗體描述中,經過其他物種的吸附處理的抗體標有“ (min X …Sr Prot) ”字樣 。

        Anti-IgG (H+L)

        這類抗體和 IgG 分子的重鏈和輕鏈都可以反應,比如,和 IgG 分子的 Fc , F(ab ’)2/Fab 部分。 Anti-IgG (H+L) 抗體也可以和其他的免疫球蛋白家族( IgM , IgA ,IgD,IgE )和亞家族反應,因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈(或者 κ 鏈,或者 λ 鏈)。 Anti-IgG (H+L) 抗體比只抗片段的抗體識別更多的抗原表位,適合普通的免疫檢查過程。

        Anti-IgG , Fc/ Fc γ fragment specific

        這類抗體和 IgG 重鏈的 Fc 部分反應。它們通過 ELISA 檢測,和 / 或針對 Fab 片段吸附測試。某些情況下,這類抗體需要額外檢測和 / 或吸收處理來降低 IgM   IgA 的交叉反應。在這種情況下( 抗人,抗鼠和抗大鼠 ),抗體標有“抗IgG  Fc γ )”,表示這類抗體只與 IgG 重鏈反應,通常不能和 IgA  IgM 任何表位反應。

        注意:不是所有 anti-IgG, Fc 抗體和所有亞型的 IgG 反應能力一致。要找和四種 IgG 亞類反應能力差不多的 抗鼠IgG, Fc γ抗體的話,應當選羊抗鼠IgG( 亞類1+2a +2b+3), Fc γ特異性片段(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot) 。

        Anti-IgG , F(ab ’)2 fragment specific

        這類抗體和 IgG  F(ab ’)2/Fab 部分反應。它們經過了 ELISA  /  Fc 片段的吸附檢測。它們不是特異性 IgG ,因為它們是和輕鏈反應的,它們同時也和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白( Ig D, IgM, IgA 和IgE )和亞類反應。

        (min X …Sr Prot)

        與一個物種反應的二抗可能與其他物種發生交叉反應,除非這類抗體經過其他物種的吸收實驗。這類抗體經過了檢測,以及針對 IgG 和圓括號中的物種的血清蛋白的吸附處理。 (標有“ (min X…Prot)” 字樣的抗體是經過了圓括號中所標的物種的 IgG  / 或血清蛋白的吸附處理的)。當其他物種免疫球蛋白的出現可能導致交叉反應時,推薦使用這類抗體。但是,當要選擇經過針對相近物種吸附處理的抗體時,要特別注意,因為它們能識別的表位數量大大減小了,可能識別單抗的能力很弱。例如,在含有內源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中,只用經大鼠 IgG 吸附處理的抗鼠 IgG 檢測大鼠組織中的鼠源一抗,或者在多標記實驗中使用了大鼠的一抗。另個一個例子是抗大鼠 IgG(min X Mouse… Sr Prot) 和抗敘利亞倉鼠 IgG  min X….Mouse, Rat Sr Prot )。

        實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

        以下是圓括號中所使用的一些簡稱:

        Bov = Bovine
              Ck = Chicken
              Gt = Goat
              GP = Guinea Pig
              Sy Hms = Syrian Hamster
              Hrs = Horse
              Hu = Human
              Ms = Mouse
              Rb = Rabbit
              Shp = Sheep
              Sw = Swine
              Sr = Serum
              Prot = Protein.

        ML  Multiple Labeling 

        有些抗體標明了“ ML  ,來強調它們除了可以用于單標,還可用于多標記實驗。

        抗亞美尼亞倉鼠IgG 和抗敘利亞倉鼠IgG

        大部分倉鼠單克隆抗體是來原于亞美尼亞倉鼠的脾臟細胞和鼠骨髓瘤細胞的雜交瘤細胞,它是亞美尼亞(而不是敘利亞)倉鼠IgG. 許多商業化的多克隆抗倉鼠IgG 是抗敘利亞倉鼠IgG, 這種抗體在檢測亞美尼亞倉鼠IgG 單克隆抗體時,它的效果沒有抗亞美尼亞倉鼠IgG 好。

        注意:抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X Bov, Hu, Ms , Rb, Rat Sr Prot) 不能識別所有的亞美尼亞倉鼠單克隆抗體,因為它經相近物種的吸附處理過(粗體字)。因此,使用經過少數物種或少數相近物種的吸附處理過的抗體可達到較好的效果,如抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X BoV Sr Prot), 除此之外,在小鼠或大鼠免疫球蛋白中也應該檢測亞美尼亞倉鼠單抗。

        第五步: 從表格頂部選擇需要的探針。

        關于探針的技術信息參考其他網頁。

        第六步:  antibody description 一行和探針欄相交處,找到選擇的抗體的價錢、規格和目錄號。

        每個方格頂部的數字是每單位的價錢,底部的 9 位數字為目錄號。

        第七步: 以定購目的查看產品說明

        為了避免錯誤,產品說明應該遵循一個特定的語法排列。比如,目錄號為 115  096  072 的產品應當描述為:

        FITC-conjugated 
        |

        AffiniPure
        |

        F(ab)2 fragment 
        |

        of Goat
        |

        Anti-Mouse 
        |

        IgG, F(ab)2 fragment specific 
        |

        A

        B

        C

        D

        E

        F

         

         

        (minimal cross-reactivity to human, bovine, and horse serum proteins) 
        |

         

        G

         

         

         

         

         

         

         

         

        A.       耦聯的探針說明,如熒光素,酶,生物素等。如果抗體沒有耦聯,不用寫。

        B .      抗體純化是商標名字,是指從抗血清中通過偶聯瓊脂糖的抗原免疫層析的方法分離得到的抗體。

        C .抗體的形式- 完整IgG, 或者 F(ab ’)2 、 Fab 片段。

        D.      抗體來源物種名稱。

        E      和該抗體反應的物種名稱。

        F.     抗體特異性描述。

        G.      經過吸附處理以后減小了交叉反應的物種名稱。  

        實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

         

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